Affinity Maturation

Analyzed examples of using the software package

This section is constantly updated, is devoted to the study of the P53 protein with small chemical molecules, DNA, and also shows the operation of the software algorithm

Therapeutic avenues to target mutant p53
Therapeutic avenues to target mutant p53
Mutant p53 proteins are highly expressed in many cancers, making them extremely attractive targets for therapy. Strategies have focused on destabilization or inactivation of mutant p53, or reactivation of wild-type function in the mutant p53 protein. The latter strategy is difficult to achieve, but particularly appealing in light of mouse models showing that the activation of wild-type p53 in established tumours can lead to efficient tumour regression89. Drugs that inhibit aggregation of certain p53 mutants have also been described[90].
Destabilization of mutant p53 has been addressed mainly by targeting heat shock proteins through histone deacetylases to rescue MDM2-dependent degradation of mutant p53 (refs 91,92), whereas disruption of mutant p53 function may be achieved by preventing its interaction with other transcription factors. To this end, the molecule RETRA has been shown to inhibit the mutant p53–p73 interaction and to restore p73 function[93]. A number of compounds or peptides that result in the reactivation of wild-type function in mutant p53 have also been described[94,95,96,97,98,99,100,101]. Some of these compounds bind to grooves in the mutant p53 proteins and readjust the folding into a wild-type conformation, but for many the exact mechanism of function is unknown. In some cases, the reactivating compound appears to be specific for a certain mutation (Y220C)[101]or for a group of mutations (conformational mutants)[94,98,99,100]. Peptides corresponding to the C-terminus of p53 have been shown to restore apoptosis induction by both structural and contact p53 mutants[96,102]. This is interesting given the importance of the C-terminus for mutant p53 function[40,50,103], but further studies are necessary to explore the mechanisms involved.
A more accessible approach may be to target the downstream pathways mediating mutant p53 activity. Mutant p53 has multiple functions — so it is unclear how effective the modulation of only one of these will be. Nevertheless, the ability of mutant p53 to engage in signalling pathways for which established, clinically approved drugs are already available (such as EGFR, MET and cholesterol synthesis pathways) gives hope that rapid progress may be made in translating such approaches into the clinic.
[Published: January 2013
p53 mutations in cancer
es.
Терапевтические возможности для воздействия на мутантный p53
Терапевтические возможности для воздействия на мутантный p53
Мутантные белки p53 высоко экспрессируются при многих видах рака, что делает их чрезвычайно привлекательными мишенями для терапии. Стратегии были сосредоточены на дестабилизации или инактивации мутантного р53 или реактивации функции дикого типа в мутантном белке р53. Последнюю стратегию трудно реализовать, но она особенно привлекательна в свете моделей на мышах, показывающих, что активация р53 дикого типа в установленных опухолях может привести к эффективной регрессии опухоли[89]. Описаны также препараты, ингибирующие агрегацию некоторых мутантов р53[90].
Дестабилизация мутантного p53 решается в основном путем нацеливания на белки теплового шока через гистоновые деацетилазы для спасения MDM2-зависимой деградации мутантного p53 (ссылки 91, 92), тогда как нарушение функции мутантного p53 может быть достигнуто путем предотвращения его взаимодействия с другими факторами транскрипции. С этой целью было показано, что молекула RETRA ингибирует взаимодействие мутантных р53-р73 и восстанавливает функцию р73[93]. Ряд соединений или пептидов, которые приводят к реактивации функции дикого типа в мутантном p53, также был описан [94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101]. Некоторые из этих соединений связываются с бороздками в мутантных белках р53 и перестраивают укладку в конформацию дикого типа, но для многих точный механизм действия неизвестен. В некоторых случаях реактивирующее соединение оказывается специфичным для определенной мутации (Y220C)101 или для группы мутаций (конформационные мутанты)[94,98,99,100]. Было показано, что пептиды, соответствующие С-концу р53, восстанавливают индукцию апоптоза как структурными, так и контактными мутантами р5396,102. Это интересно, учитывая важность С-конца для функции мутантного р53 40, 50, 103, но необходимы дальнейшие исследования для изучения задействованных механизмов.
Более доступным подходом может быть нацеливание на нижележащие пути, опосредующие активность мутантного р53. Мутантный р53 выполняет несколько функций, поэтому неясно, насколько эффективной будет модуляция только одной из них. Тем не менее, способность мутантного p53 участвовать в сигнальных путях, для которых уже доступны установленные, клинически одобренные лекарства (такие как пути синтеза EGFR, MET и холестерина), дает надежду на быстрый прогресс в переводе таких подходов в клинику.
Далее приведен пример ввода данных для решения поставленной задачи, а именно: Как влияет мутация Y220C на взаимодействие с малой химической молекулой PhiKan5196.

Слева на рисунке приведена трехмерная модель комплекса: P53 (Y220C)-PhiKan5196. Зеленым цветом обозначена малая химическая молекула PhiKan5196, красным цветом указана мутация в белке Р53 Y220C

Поскольку трехмерная структура была выполнена с мутантным белком Р53, который связался с малой химической молекулой, то здесь мы анализируем изменение физических свойств комплекса при переходе мутантной формы белка к биологическому комплексу дикого типа wtP53-PhiKan5196.

В процессе расчетов мы заменили мутантную форму белка на дикий тип путем замены аминокислотного остатка под номером 220.

На рисунке слева приведены окна ввода для замены аминокислотных остатков в белке Р53. Порядковый номер аминокислотного остатка в базе данных PDB составляет 125.

Calculation results:

4AGO
Structure of the p53 core domain mutant Y220C bound to the stabilizing small molecule PhiKan5174

wtP53-PhiKan5196
number condition error computational SVD
6.54789180758048
№=125
mutP53(Y220C)-PhiKan5196
number condition error computational SVD
6.57147885270406

Difference in differential entropy
one-dimensional entropy (delta)H=-1,372791
multidimensional entropy
(delta)H=-3,97551

Graphical representation of the definition of a conformational transition
На рисунке внизу представлены численные результаты расчета малой хим.молекулы с мутантной формой и дикой формой белка Р53. Как видно из представленных графиков, направления изменения величин lg(cond(W)) and (delta)H при переходе системы дикого типа к мутантной форме.

Как видно из левого графика, при переходе системы от системы дикого типа к мутантной форме, величина lg(cond(W)) увеличивается, а величина (delta)H находится в отрицательной области значений.

Таблица справа показывается значения потенциальной энергии попарного взаимодействия при замене аминокислотного остатка 220 в белке Р53.
На рисунке ниже представлена структура малой молекулы PhiKan5174, а так же приведены значения зарядов атомов, расчитанных в программе CHEMICAL
Small molecule PhiKan5174
Ниже на графике приведены эксперимнетальные данные для молекулы PhiKan5174
CELL VIABILITY OF NUGC-3 (Y220C) AND NUGC-4 (WILD-TYPE P53) CELLS AFTER TREATMENT WITH DIFFERENT CONCENTRATIONS OF PHIKAN5196.
[HALOGEN-ENRICHED FRAGMENT LIBRARIES AS LEADS FOR DRUG RESCUE OF MUTANT P53 \\RAINER WILCKEN, XIANGRUI LIU, MARKUS O. ZIMMERMANN, TREVOR J. RUTHERFORD, ALAN R. FERSHT,ANDREAS C. JOERGER AND FRANK M. BOECKLER ]

You can download and view the calculation files


The procedure for using the software package and entering parameters for calculation

В данном разделе приведены примеры использования программного комплекса для вычисления физических параметров взаимодействия белка Р53 и малой химической молекулы. Для расчета необходимо выбрать опцию "Protein and small chemical molecule".

В следующем диалоговом окне вводите параметры считваемых программой файлов, их названия, формат pdb для белка и для малой химической молекулы, а так же файл со значением зарядов всех атомов для малой химической молекулы в формате .txt

Следующее диалоговое окно запрашивает данные о замене аминокислотных остатков в белке, вводите количество заменяемых аминокислотных остатков, их порядковые номера, трехбуквенное наименование.

4AGP
Structure of the p53 core domain mutant Y220C bound to the stabilizing small molecule PhiKan5176
Kd=20,6E-6 M (ITC)
Calculation results:

wtP53-PhiKan5176
number condition error computational SVD
5,9559409
№=125
mutP53(Y220C)-PhiKan5176
number condition error computational SVD
5,97704155

Difference in differential entropy
one-dimensional entropy (delta)H=-1,372791

The results of molecular docking, in which we performed the superimposition of the wild and mutant forms of the protein without shifting the position of the small molecule
Поскольку все ранее выполненные расчеты указывают на конформационные изменения при связывании малой хим. молекулы с мутантной формой белка Р53 по сравнению с дикой формой белка Р53, то мы выполнили трехмерное моделирования, имитирующее сравнение структур мутантного и дикого типа белка Р53 при связывании с малой хим. молекулой.

При наложении структур мы четко видим перекрывании электронных орбиталей, если не случится конформационная подвижка и сдвиг малой хим.молекулы при связывании с белком дикого типа.

Таким образом, при замене в мутантной форме белка Р53 Тирозина (TYR) на цистеин (CYS) должно произойти изменение положения малой хим. молекулы.
Так же был выполнен расчет физических параметров биокомплекса после выполненного фталинга и наложения структуры мутантной и дикой формы белка Р53 с малой хим. молекулой.

Результаты расчеты так же указали на изменение конформации при переходе из одной системы в другую систему.
wtP53-PhiKan5176
number condition
5,86393166
№=125
mutP53(Y220C)-PhiKan5176
number condition
5,894002836

Difference in differential entropy
one-dimensional entropy (delta)H=-1,372791
Трехмерная структура малой хим. молекулы PHIKAN5176 и значения зарядов для атомов, найденных с помощью программы Chemical
small molecule PhiKan5176

Calculation results:

wtP53-PhiKan5174
number condition error computational SVD
5.91888038771301 2.82486370137760e-37
№=125
mutP53(Y220C)-PhiKan5174
number condition error computational SVD
5.95153222788592 1.56329964280615e-37

Change of differential entropy is '-1.372791e+00'.
CELL VIABILITY OF NUGC-3 (Y220C) AND NUGC-4 (WILD-TYPE P53) CELLS AFTER TREATMENT WITH DIFFERENT CONCENTRATIONS OF PHIKAN5174.
[HALOGEN-ENRICHED FRAGMENT LIBRARIES AS LEADS FOR DRUG RESCUE OF MUTANT P53 \\RAINER WILCKEN, XIANGRUI LIU, MARKUS O. ZIMMERMANN, TREVOR J. RUTHERFORD, ALAN R. FERSHT,ANDREAS C. JOERGER AND FRANK M. BOECKLER ]

You can download the calculation files

The synthesized chemical probe MB710, an aminobenzothiazole derivative, binds tightly to the Y220C pocket and stabilizes p53- Y220C in vitro. MB725, an ethylamide analogue of MB710, induced selective viability reduction in several p53-Y220C cancer cell lines while being well tolerated in control cell lines. Reduction of viability correlated with increased and selective transcription of p53 target genes such as BTG2, p21, PUMA, FAS, TNF, and TNFRSF10B, which promote apoptosis and cell cycle arrest, suggesting compound-mediated transcriptional activation of the Y220C mutant. Our data provide a framework for the development of a class of potent, non-toxic compounds for reactivating the Y220C mutant in anticancer therapy.
[Aminobenzothiazole derivatives stabilize the thermolabile p53 cancer mutant Y220C and show anticancer activity in p53-Y220C cell lines]
Синтезированное химическое производное MB710, аминобензотиазола, прочно связывается с карманом Y220C и стабилизирует p53- Y220C in vitro. MB725, этиламидный аналог MB710, вызывал селективное снижение жизнеспособности несколько линий раковых клеток p53-Y220C, в то время как он хорошо переносится в контрольных клеточных линиях. Снижение жизнеспособности коррелирует с повышенной и селективной транскрипцией генов-мишеней p53, таких как BTG2, p21, PUMA, FAS, TNF и TNFRSF10B, которые способствуют апоптозу и остановке клеточного цикла, что предполагает опосредованное соединением активация транскрипции мутанта Y220C. Наши данные обеспечивают основу для разработки класс сильнодействующих нетоксичных соединений для реактивации мутанта Y220C в противоопухолевой терапии.

Calculation results:

wtP53-MB710
number condition error computational SVD
18.76048780155429
№=125
p53 cancer mutant Y220C in complex with compound MB710
number condition SVD
18.95849499061643
Kd of 4 mM (ITC)
The observed binding-affinity increase of MB710 may be explained by its more favorable entropic term due to higher conformational restriction and additional hydrophobic contacts.
Наблюдаемое увеличение аффинности связывания MB710 можно объяснить его более благоприятным энтропийным термином из-за более высокого конформационного ограничения и дополнительных гидрофобных контактов.
~
R249
Structural studies have shown that in the wt protein, either free or bound to its DNA target, R249 stabilizes p53 by
forming a bidentate salt bridge and several hydrogen
bonds with adjacent residues, thereby linking
two flexible loops, L2 and L3
R249S
Substitution of R249 by serine (R249S) is highly frequent in hepatocellular carcinoma, especially in eastern Asia and sub-Saharan Africa. This mutation is specifically induced by the mycotoxin aflatoxin B1

R249S is highly frequent also in lung cancers due to a similar G to T transversion caused by tobacco smoke compounds, such as benzo[a] pyrene-7,8-diol-9,10-epoxide.

Upon mutation to serine, the mentioned interactions are lost and, as a result, the R249S core domain mutant is destabilized by nearly 2 kcal/mol, denatures faster and shows a drastic reduction in its DNA binding affinity relative to that of the wt core domain
R249S/H168R/T123A
It was shown that transcriptional activity of R249S mutant could be partially restored by the simultaneous introduction of two suppressor mutations: H168R and T123A.

Transactivation assays performed in yeast as well as in human cancerous cell line showed that the triple mutant R249S/H168R/T123A transactivated p53 target genes at a level of about 40% of that shown by wt p53, whereas in vitro studies showed that the introduction of H168R alone into R249S is sufficient for restoring DNA binding activity of the protein.

The crystal structures of T-p53C incorporating two mutations—R249S with H168R—or three mutations—R249S with both H168R and T123A—showed that R168 restores the wt conformation by mimicking the stabilizing role of R249 in wt p53.
TP53 mutations in patients with de novo acute myeloid leukemia (AML) patients with complex karyotype (CK).
Sequential study of 420 samples showed that TP53 mutations
were stable during AML evolution, whereas the mutation was acquired only in 1 of the 126 TP53 wild-type patients when therapyrelated AML originated from different clone emerged. In conclusion, TP53 mutations are associated with distinct clinic-biological features and poor prognosis in de novo AML patients and are rather stable during disease progression.
ORIGINAL ARTICLE TP53 mutations in de novo acute myeloid leukemia patients: longitudinal follow-ups show the mutation is stable during disease evolution

__________________________________
3D0A
[wtP53-DNA]2
12,0446113

[mutP53-DNA]2
Human p53 core domain with hot spot mutation R249S and second site suppressor mutation H168R in sequence-specific complex with DNA
12,04372301

[mutP53-DNA]2
R249S/H168R/T123A
12,04371202

[mutP53-DNA]2
R249S
12,0446537

«
T-cell receptors (TCRs)
Adoptive cell therapy (ACT)

We detected no apparent interaction between any of these TCRs and wild-type p53–HLA-A2, even after injecting high concentrations of TCR (up to 328 μM for 12-6, 232 μM for 38-10, and 153 μM for 1a2)

By contrast, these TCRs bound mutant p53R175H–HLA-A2 with dissociation constants (KDs) of 1.1 μM for 12-6, 39.9 μM for 38-10, and 16.2 μM for 1a2 (Fig. 1d–f). These affinities are well within the range of TCRs specific for microbial or other foreign antigens (KD = 1–50 μM), but substantially higher than the affinities of autoimmune TCRs that recognize non-mutated self-antigens (KD > 100 μM).
The exquisite specificity of 12-6, 38-10, and 1a2 for p53R175H compared with p53, as measured by SPR, is consistent with functional assays showing that T cells transduced with these TCRs can be activated by APCs pulsed with subnanomolar concentrations of mutant p53R175H peptide, but do not respond to wild-type p53 peptide, even at >1000-fold higher concentrations.
[Structural basis for oligoclonal T cell recognition of a shared p53 cancer neoantigen]



Мы не обнаружили явного взаимодействия между любым из этих TCR и p53-HLA-A2 дикого типа даже после введения высоких концентраций TCR (до 328 мкМ для 12-6, 232 мкМ для 38-10 и 153 мкМ для 1a2).


Напротив, эти TCR связывали мутантный p53R175H-HLA-A2 с константами диссоциации (KD) 1,1 мкМ для 12-6, 39,9 мкМ для 38-10 и 16,2 мкМ для 1a2 (рис. 1d-f). Это сродство находится в пределах диапазона TCR, специфичных для микробных или других чужеродных антигенов (KD = 1–50 мкМ), но значительно выше, чем сродство аутоиммунных TCR, которые распознают немутированные аутоантигены (KD> 100 мкМ).
Исключительная специфичность 12-6, 38-10 и 1a2 для p53R175H по сравнению с p53, измеренная с помощью SPR, согласуется с функциональными анализами, показывающими, что Т-клетки, трансдуцированные этими TCR, могут быть активированы APC, импульсами которых являются субнаномолярные концентрации мутантного p53R175H. пептида, но не реагируют на пептид р53 дикого типа даже при более чем в 1000 раз более высоких концентрациях.
Adoptive cell therapy (ACT) with tumor-specific T cells can mediate cancer regression. The main target of tumor-specific T cells are neoantigens arising from mutations in self-proteins. Although the majority of cancer neoantigens are unique to each patient, and therefore not broadly useful for ACT, some are shared. We studied oligoclonal T-cell receptors (TCRs) that recognize a shared neoepitope arising from a driver mutation in the p53 oncogene (p53R175H) presented by HLA-A2. Here we report structures of wild-type and mutant p53–HLA-A2 ligands, as well as structures of three tumor-specific TCRs bound to p53R175H–HLA-A2. These structures reveal how a driver mutation in p53 rendered a selfpeptide visible to T cells. The TCRs employ structurally distinct strategies that are highly focused on the mutation to discriminate between mutant and wild-type p53. The TCR–p53R175H–HLA-A2 complexes provide a framework for designing TCRs to improve potency for ACT without sacrificing specificity.
[Structural basis for oligoclonal T cell recognition of a shared p53 cancer neoantigen]
Адоптивная клеточная терапия (ACT) опухолеспецифическими Т-клетками может способствовать регрессии рака. Основной мишенью опухолеспецифических Т-клеток являются неоантигены, возникающие в результате мутаций собственных белков. Хотя большинство раковых неоантигенов уникальны для каждого пациента и, следовательно, не очень полезны для АКТ, некоторые из них являются общими. Мы изучили олигоклональные Т-клеточные рецепторы (TCR), которые распознают общий неоэпитоп, возникающий в результате драйверной мутации в онкогене p53 (p53R175H), представленном HLA-A2. Здесь мы сообщаем о структурах дикого типа и мутантных лигандах p53-HLA-A2, а также о структурах трех опухолеспецифических TCR, связанных с p53R175H-HLA-A2. Эти структуры показывают, как драйверная мутация в р53 делает аутопептид видимым для Т-клеток. TCR используют структурно отличные стратегии, которые в значительной степени сосредоточены на мутации, чтобы различать мутантный p53 и р53 дикого типа. Комплексы TCR-p53R175H-HLA-A2 обеспечивают основу для конструирования TCR для повышения эффективности ACT без ущерба для специфичности.
A major challenge in developing broadly applicable
neoantigen-directed ACT is the unique neoantigen repertoire of
each cancer patient. There are few shared mutated targets among patients, even among patients with similar cancers. For example, in a study of patients with gastrointestinal cancers, 99% of neoantigenic determinants recognized by neoantigen-reactive TILs were unique (private) and not shared (public) between any two patients. Nevertheless, it has been possible to identify a limited number of shared cancer neoantigens. Of particular interest are neoantigens derived from oncogenes bearing driver mutations because these mutations are tumor-specific, biologically important for tumor progression, and likely to be expressed by all tumor cells. In a seminal study of ACT, a patient with metastatic colorectal cancer was treated effectively with four distinct CD8+ T cell clones that specifically targeted a neoepitope arising from the KRAS G12D driver mutation in an HLAC*08:02-restricted manner.




Other shared mutated neoantigens expressed by cancers of
unrelated patients have now been identified. TP53, which encodes the tumor suppressor p53, is the most frequently mutated gene across all cancer types . Indeed, TP53 mutations are found in 40–50% of cancer patients, and effect most of the hallmarks of cancer cells, including genomic instability, proliferation, and metastasis.

Mutant p53 predisposes to cancer development
and is associated with ineffective therapeutic responses and
unfavorable prognoses10. Despite these effects, no drug to abrogate the oncogenic functions of mutant p53 has yet been
approved for any cancer treatment. A substantial portion of TP53 mutations occur at hotspot positions R175, G245, R248, R249, R273, and R28210. Because mutations at these sites confer a growth advantage to tumor cells and are associated with malignant progression, they are attractive candidates for targeted immunotherapy.

The immunogenicity of p53 mutations in patients with cancer
was recently demonstrated by the detection of T responses against several shared p53 neoantigens, notably R175H and R248W. Both of these driver mutations are located in the DNA-binding domain of p53 and alter its DNA-binding capacity
. Several TCRs have been isolated from TILs of epithelial cancer patients that recognize a neoepitope corresponding to residues 168–176 of p53R175H. This neoepitope includes the arginine-to-histidine mutation at position 175 (HMTEVVRHC). The TCRs are restricted by the common MHC class I allele HLA-A*02:01. These oligoclonal TCRs, transduced at high frequency into a patient's peripheral blood lymphocytes for ACT, may prove effective in eliminating tumors expressing HLA-A*02:01 and the p53R175H mutation

With the goal of understanding TCR recognition of cancer
neoantigens at the atomic level, we determined crystal structures of three p53R175H-specific TCRs (12-6, 38-10, and 1a2) in complex with HLA-A*02:01 and the shared neoantigen p53R175H. In previous studies, we determined structures of human melanoma-specific TCRs bound to a neoepitope from mutant triose phosphate isomerase (mutTPI) and HLA-DR1. However, that neoepitope, unlike KRAS G12D2 or p53R175H10,was only expressed in a single melanoma
patient.

The unique, rather than shared, nature of mutTPI, a feature that also characterizes the vast majority of cancer neoantigens discovered to date, precludes broad use of mutTPI-specific or similar TCRs in ACT. Structures have also been reported of TCRs in complex with epitopes from the tumor-associated antigens NY-ESO-1 and MART-1 bound to HLA-A2. However, NY-ESO-1 and MART-1, unlike mutTPI15 or p53R175H, are not neoantigens, but instead non-mutated self-antigens that are selectively expressed in certain cancer types. By contrast, the TCR–p53R175H–HLA-A2 structures described here involve a shared cancer neoantigen. The structures reveal how oligoclonal TCRs 12-6, 38-10, and 1a2 discriminate between wild-type and mutated p53, and demonstrate that there are multiple distinct solutions to recognizing the p53R175H neoepitope with sufficient affinity to mediate tumor cell killing.
[Structural basis for oligoclonal T cell recognition of a shared p53 cancer neoantigen]
Серьезная проблема в разработке широко применимых
Неоантиген-направленная АКТ представляет собой уникальный неоантигенный репертуар
каждый онкологический больной. Среди пациентов мало общих мутировавших мишеней, даже среди пациентов с похожими видами рака. Например, в исследовании пациентов с раком желудочно-кишечного тракта 99% неоантигенных детерминант, распознаваемых неоантиген-реактивными TIL, были уникальными (личными) и не разделялись (общедоступными) между какими-либо двумя пациентами. Тем не менее, удалось идентифицировать ограниченное число общих неоантигенов рака. Особый интерес представляют неоантигены, полученные из онкогенов, несущих драйверные мутации, поскольку эти мутации являются опухолеспецифичными, биологически важными для опухолевой прогрессии и, вероятно, экспрессируются всеми опухолевыми клетками. В основополагающем исследовании ACT пациент с метастатическим колоректальным раком был эффективно пролечен четырьмя различными клонами CD8+ Т-клеток, которые специфически нацелены на неоэпитоп, возникающий в результате мутации драйвера KRAS G12D, с ограничением HLAC*08:02.

Другие общие мутировавшие неоантигены, экспрессируемые раком в настоящее время выявлены неродственные пациенты. TP53, который кодирует супрессор опухоли p53, является наиболее часто мутирующим геном при всех типах рака. Действительно, мутации TP53 обнаруживаются у 40–50% больных раком и влияют на большинство признаков раковых клеток, включая геномную нестабильность, пролиферацию и метастазирование.
Мутантный p53 предрасполагает к развитию рака
и связано с неэффективным терапевтическим ответом и
неблагоприятный прогноз 10. Несмотря на эти эффекты, до сих пор не разработано лекарство, способное отменить онкогенные функции мутантного p53 одобрен для любого лечения рака. Значительная часть мутаций TP53 происходит в позициях горячих точек R175, G245, R248, R249, R273 и R28210. Поскольку мутации в этих участках обеспечивают рост опухолевых клеток и связаны со злокачественным прогрессированием, они являются привлекательными кандидатами для таргетной иммунотерапии.

Иммуногенность мутаций р53 у онкологических больных
недавно было продемонстрировано обнаружением Т-ответов против нескольких общих неоантигенов p53, особенно R175H и R248W. Обе эти драйверные мутации расположены в ДНК-связывающем домене p53 и изменяют его ДНК-связывающую способность
. Несколько TCR были выделены из TIL пациентов с эпителиальным раком, которые распознают неоэпитоп, соответствующий остаткам 168–176 p53R175H. Этот неоэпитоп включает мутацию аргинина в гистидин в положении 175 (HMTEVVRHC). TCR ограничены общим аллелем MHC класса I HLA-A * 02:01. Эти олигоклональные TCR, трансдуцированные с высокой частотой в лимфоциты периферической крови пациента для АКТ, могут оказаться эффективными в элиминации опухолей, экспрессирующих HLA-A*02:01 и мутацию p53R175H.

С целью понимания распознавания рака TCR неоантигенов на атомном уровне, мы определили кристаллические структуры трех p53R175H-специфических TCR (12-6, 38-10 и 1a2) в комплексе с HLA-A*02:01 и общим неоантигеном p53R175H. В предыдущих исследованиях мы определили структуры TCR, специфичных для меланомы человека, связанных с неоэпитопом из мутантной триозофосфатизомеразы (mutTPI) и HLA-DR1. Однако этот неоэпитоп, в отличие от KRAS G12D2 или p53R175H10, экспрессировался только в одной меланоме.
пациент.

Уникальная, а не общая природа mutTPI, особенность, которая также характеризует подавляющее большинство раковых неоантигенов, открытых на сегодняшний день, препятствует широкому использованию mutTPI-специфических или подобных TCR в ACT. Сообщалось также о структурах TCR в комплексе с эпитопами опухолеассоциированных антигенов NY-ESO-1 и MART-1, связанных с HLA-A2. Однако NY-ESO-1 и MART-1, в отличие от mutTPI15 или p53R175H, являются не неоантигенами, а немутировавшими аутоантигенами, которые избирательно экспрессируются при определенных типах рака. Напротив, описанные здесь структуры TCR-p53R175H-HLA-A2 включают общий раковый неоантиген. Структуры показывают, как олигоклональные TCR 12-6, 38-10 и 1a2 различают p53 дикого типа и мутантный, и демонстрируют, что существует множество различных решений для распознавания неоэпитопов p53R175H с достаточной аффинностью, чтобы опосредовать уничтожение опухолевых клеток.

На рисунках справа приведена схема определения изменения физических параметров связывания биологического комплекса в тример при различных заменах в HLAA2 в области двух альфа-спиралей, контактирующих с пептидом белка Р53.

На верхнем графике показаны численные результаты расчетов изменения устойчивости системы при выполненных заменах, пунктирной линий указано значения lg(cond(W)), соответствующее тримеру дикого типа.

Ниже на графике представлены результаты вычислений для разницы дифференциальной энтропии систем для каждой выполненной замены.

При этом если значения разницы дифференциальной энтропии (delta)H находятся в отрицательном диапазоне, а величина lg(cond(W)) ниже значения lg(cond(W)) для тримера дикого типа, то такое одновременное изменение мы трактуем, как увеличение аффинности.



На следующем графике представлены результаты двух замен одновременно в HLAA2 при образовании тримерного комплекса.

Замены были выбраны с учетом увеличения аффинности из предыдущих расчетов, представленных на графике выше.

Мы преследовали две цели при отборе замен:
1. величина lg(cond(W)) после выполненных замен должна быть меньше значения wt

2. Система после выполненных замен должна переходить к значениям с меньшим показателем энтропии, чем система wt.
Данный показатель представлен на графике, как разность энтропий систем до и после замен.

Как видно из представленных графиков, все три значения разницы дифференциальных энтропий находятся в отрицательной области значений.


Mutational Analysis of Peptide Inhibition of the p53-
MDM2/MDMX Interactions
Выполнение аланинового сканирования модифицированного пептида белка P53 при связывании с белком Mdm2
В данном разделе мы анализируем изменение физических параметров связывания модифицированного пептида белка Р53 с белком MDM2. В данном случае модифицированный пептид конкурирует с беком Р53 за участок связывания на белке Mdm2.

В работе выполнено аланиновое сканирования пептида, используя данные X-ray scattering, а так же данные молекулярного докинга, которые на рисунках именуются "ftaling" по методу сопоставления трехмерных структур, полученных различными способами.

На верхнем графиком (красный цвет) приведены данные Kd, поулченные в исследовательской работе в 2010 году.
E-mail
You can leave a comment by choosing several options or send your message
Message
Or you can choose the most suits for you
Choose the right option
Made on
Tilda